PCR实验是分子生物学研究的核心技术之一，具有高灵敏度和特异性。但实验对环境和操作的要求极高，一旦发生污染，轻则导致实验数据无效，重则干扰整个研究进程。

一、PCR实验常见污染类型

1．标本间交叉污染

（1）收集标本的容器被污染，或标本放置时密封不严溢于容器外，或容器外粘有标本而造成交叉污染

（2）标本核酸模板提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染

（3）微生物标本尤其是病毒可随气溶胶扩散或形成气溶胶而扩散，导致彼此间的污染

2．PCR试剂污染

（1）在PCR试剂配制过程中，加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染（例如，加样过程中冰浴操作不当导致试剂暴露于污染环境）

3．PCR扩增产物污染

（1）PCR产物拷贝量极高（约10^13拷贝/ml），微量残留即可引发假阳性

（2）气溶胶污染（最常见的污染问题）：空气与液体面摩擦时会形成气溶胶，操作过程中，剧烈摇动反应管、开盖、吸样以及污染进样枪的反复吸样，都可形成气溶胶而导致污染

4．克隆质粒污染

（1）采用克隆质粒做阳性对照时，由于克隆质粒单位容积内含量高，在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞生长繁殖的简便性及强大的生命力，其污染可能性也很大

5．实验设备及环境污染

（1）扩增仪、生物安全柜等设备未彻底消毒，或实验室台面通风系统残留核酸片段，通过接触或空气循环传播污染

二、污染防控与处理措施

1．实验室设计与操作规范

（1）严格分区管理：按功能划分试剂准备区、样本制备区、扩增区及产物分析区，各区独立通风且压差梯度递减（建议>5Pa），确保空气单向流动，实验流程需单向进行，禁止逆向操作

（2）使用专用设备与耗材：各区配备独立移液器、实验服和耗材，使用带滤芯吸头防止气溶胶吸入移液器管腔，扩增产物分析区设备不得与其他区域混用

2．消毒与清洁程序

（1）化学消毒：使用2000mg/L有效氯消du液浸泡移液枪、离心管架等器材，500mg/L浓度用于台面及环境喷雾；污染严重时采用过氧化氢熏蒸（2g/m³）或过氧乙酸喷雾（8ml/m³）

（2）物理灭活：紫外辐照，实验后使用移动紫外灯近距离照射设备1小时，全室紫外灯整夜开启;酶灭活法，在PCR体系中加入尿嘧啶糖苷酶（UNG），降解含dUTP的既往扩增产物

3．实验操作控制

（1）防气溶胶措施：开盖前离心反应管，轻柔操作避免液体飞溅;生物安全柜内处理潜在传染性样本，并定期更换过滤网

（2）污染监测：阴性对照，每批次实验设置无模板对照（NTC），连续3天阴性方确认污染消除；擦拭检测，定期用拭子采集台面/设备样本进行PCR检测，监控污染源

4．应急处理流程

（1）污染事件响应：立即停止实验→标识污染区域→按梯度消毒（先局部后全面）→验证阴性对照→记录处理过程

（2）设备深度处理：全自动提取仪等污染设备需用核酸气溶胶清除剂（如DNAAWAY原液）反复擦拭，必要时拆卸清洁内部组件

三、追踪污染源

1．设立阴阳性对照

（1）阳性对照：选择扩增度中等、重复性好，经各种鉴定是该产物的标本，如以重组质粒为阳性对照，其含量宜低不宜高（100个拷贝以下）。但阳性对照尤其是重组质粒及高浓度阳性标本，其对检测或扩增样品污染的可能性很大

（2）阴性对照：每次PCR实验务必做阴性对照，它包括：

①标本对照：被检的标本是血清就用鉴定后的正常血清作对照，被检的标本是组织细胞就用相应的组织细胞作对照

②试剂对照：在PCR试剂中不加模板DNA或RNA，进行PCR扩增，以监测试剂是否污染

2．环境污染

在排除试剂污染的可能性后，环境污染中常见的污染源主要有：

①模板提取时真空抽干装置

②凝胶电泳加样器

③电泳装置

④紫外分析仪

⑤切胶用刀或手术刀片

⑥离心机

⑦冰箱门把手，冷冻架，门把手或实验台面等

⑧气溶胶

如果经过上述追踪实验，仍不能查找到确切污染源，则污染可能是由空气中PCR产物的气溶胶造成的，此时就应该更换实验场所，若条件不允许，则重新设计新的引物

四、实验操作注意事项

1．戴一次性手套，若不小心溅上反应液，立即更换手套

2．使用一次性吸头，吸头不要长时间暴露于空气中，避免气溶胶的污染

3．避免反应液飞溅，打开反应管时为避免此种情况，开盖前稍离心收集液体于管底。若不小心溅到手套或桌面上，应立刻更换手套并用稀酸擦拭桌面

4．操作多份样品时，先将dNTP、缓冲液、引物和酶混合好，然后分装，这样即可以减少操作，避免污染，又可以增加反应的精确度，最后加入反应模板，加入后盖紧反应管

5．操作时设立阴阳性对照和空白对照，即可验证PCR反应的可靠性，又可以协助判断扩增系统的可信性

6．尽可能用可替换或可高压处理的加样器，如没有这种特殊的加样器，至少PCR操作过程中加样器应该专用，不能交叉使用重复实验，验证结果，慎下结论