一、免疫荧光常用染料

1. FITC（异硫氰酸荧光素）

①激发波长490nm，发射波长525nm，绿色荧光在常规显微镜下清晰可见。

②价格低，标记效率高，但光稳定性差，曝光时间超过30秒易出现信号衰减。

【注意事项】FITC在酸性环境下荧光强度下降，因此固定细胞时需用PBS彻底冲洗。

2. TRITC（四甲基罗丹明异硫氰酸酯）

①激发波长557nm，发射波长576nm，红色荧光，常与FITC搭配做双标实验。

②分子量比FITC大，对抗体活性影响更明显，建议抗体浓度不低于5ug/ml。

【注意事项】遇到背景偏高时，用1%BSA封闭能减少非特异性吸附。

3. Cy系列（Cy3、Cy5、Cy7）

①Cy3：激发波长550，发射波长570nm，橙红色荧光，亮度高，但光稳定性较差。

②Cy5：激发波长649nm，发射波长576nm，远红外荧光，穿透力强，需共聚焦显微镜检测。

③Cy7：激发波长743nm，发射波长767nm，近红外荧光，适用于活体实验。

4. Alexa Fluor系列染料（AF488绿色、AF555橙红色、AF647远红等）

①光稳定性比传统染料强3~5倍，适合长时间动态观察。

②光谱间距优化（25~30nm），串扰低（<5%），pH耐受范围广（pH4-10）。

【注意事项】AF647发射波长在近红外区，普通显微镜需更换滤光片组。

5. DAPI（4’，6-二脒基-2-苯基吲哚）

①专染细胞核，激发波长358nm，蓝色荧光，需配备紫外光源。

②能穿透活细胞膜，但浓度超过1ug/mL会产生细胞毒性。

【注意事项】做活细胞成像时建议改用Hoechst 33342，该染料激发波长更接近可见光范围，对细胞损伤较小。

6. Hoechst

①激发波长355nm，发射波长461nm，蓝色荧光，可以穿透细胞膜对细胞核内DNA染色。

②溶于水和有机溶液，荧光强度随溶液pH升高而增强。

③毒性低，适用于活细胞核染色。

7. PI（碘化丙啶）

①激发波长538nm，红色荧光，能够与DNA强力结合。

②嵌入双链DNA后释放红色荧光，实现对DNA或细胞核的染色。不能通过活细胞膜，仅标记死细胞DNA，用于细胞活力检测。

8. CF系列（CF350蓝色、CF488A绿色、CF647远红等）

①水溶性极好，非特异性结合少，光稳定性强，量子产率高。

②适用于长时间成像和高信噪比实验。

二、如何根据需求选择染料

1、实验类型

单标：传统染料（FITC）或高亮度染料（AF488）。

多标：光谱无重叠的染料组合（如AF488+AF555+AF647）优先选Alexa Fluor或CF系列减少串扰。

2、样本类型
固定样本：Alexa Fluor或CF系列。

活体/活细胞：近红外染料（Cy7、CF790）减少自发荧光干扰或Hoechst。

3、信号强度与背景控制
低丰度靶标：高量子产率染料（AF555、CF568）。

高背景样本：CF系列（非特异性结合少）。

4、成本与实验周期

预算有限：传统染料（FITC、TRITC）。

长期成像：必选 Alexa Fluor或CF系列抵抗光漂白。