首先引物要跟模板紧密结合，其次引物与引物之间不能有稳定的二聚体或发夹结构存在，再次引物不能在别的非目的位点引起DNA聚合反应（即错配）。围绕这几条基本原则，设计引物需要考虑诸多因素，如引物长度（primer length）、产物长度（product length）、序列Tm值(melting temperature)、ΔG值(internal stability)、引物二聚体及发夹结构（duplex formation and hairpin）、错误引发位点（false priming site）、引物及产物GC 含量（composition），有时还要对引物进行修饰，如增加限制酶切点，引进突变等。

　　PCR引物设计原则：

　　1、引物长度一般为15-30碱基，最好在模板cDNA的保守区内设计。

　　2、G+C含量在40%~60%之间。

　　3、碱基要随机分布。

　　4、引物自身不能有连续4个碱基的互补。

　　5、引物之间不能有连续4个碱基的互补。

　　6、引物5′端可以修饰。

　　7、引物3′端不可修饰。

　　8、引物3′端要避开密码子的第3位。如果扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。

　　9、3’端最好不要是连续碱基，GGG或CCC会导致错误的引发。

　　10、Tm值最好接近72℃，有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。Tm值计算公式为：

　　Tm=4（G+C）+2(A+T) （此公式试用于引物长度20mer及以下的引物）。更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为Tm=0.41（% of GC）-675/L+81.5   % of GC为引物GC含量(GC个数、引物总碱基数)，L为引物碱基数。（计算公式是否附在此处。）

　　11、引物5′端和中间△G值应该相对较高，而3′端△G值较低。