研究细胞活力和细胞凋亡的实验方案

　　1、贴壁细胞：

　　去除培养基并用 PBS 洗涤细胞单层

　　添加解离剂（例如胰蛋白酶）并在 37°C 下孵育 5 分钟或直至细胞从细胞培养皿中分离。

　　添加含血清培养基或胰蛋白酶抑制剂以灭活解离剂。

　　将细胞转移到微量离心管中。

　　悬浮细胞：将细胞转移到微量离心管中。

　　2、通过离心（300 G，室温下 5 分钟）沉淀细胞。去除培养基并重新悬浮在含有钙离子的 PBS 或 HBSS 中。

　　注意：膜联蛋白 V 需要钙才能与磷脂相互作用。用钙盐补充缓冲液，避免使用螯合剂，如 EDTA 或 EGTA。

　　3、计数细胞并在每个条件下取一百万 (10 6 ) 个细胞：

　　未染色样品——用于建立自发荧光水平

　　用活性染料染色的样品

　　用膜联蛋白 V 探针染色的样品

　　用活力染料和膜联蛋白 V 探针染色的样品

　　注 1：Annexin V 和活性染料必须具有不同的激发光谱才能区分它们的染色。有关多色设计实验的提示，请参阅第 4 节。

　　注 2：考虑包括阳性对照样品，其中细胞用诱导细胞死亡的试剂处理，以验证所用探针的性能。

　　4、添加荧光标记的膜联蛋白 V 并在室温下孵育 15 分钟。

　　膜联蛋白 V 优先结合磷脂酰丝氨酸，磷脂酰丝氨酸存在于活细胞质膜的内层。在早期凋亡细胞中，磷脂酰丝氨酸易位到外层，使其易于与膜联蛋白 V 结合。

　　5、通过离心（300 G，室温下 5 分钟）沉淀细胞。去除培养基并在 PBS 或 HBSS 中重悬。

　　6、添加活力染料（例如碘化丙啶）并在室温下孵育 5-20 分钟。

　　碘化丙啶 (PI) 是一种 DNA 嵌入剂 - 它用作与 DNA 结合的荧光染料。死细胞失去细胞膜完整性，这使得染料能够到达细胞核并与核酸结合。

　　7、在流式细胞仪上分析细胞。

　　注意：在分析前不要清洗细胞，以避免洗掉死细胞中积累的活力染料。