1. 模板DNA

2. 引物

3. 四种脱氧核糖核苷酸

4. DNA聚合物

5. 反应缓冲液、Mg2等

二、反应成分：

    1、模板DNA

    2、引物

    3、四种脱氧核糖核苷酸

    4、DNA聚合物

    5、反应缓冲液、Mg2等

三、基本步骤：

    1、变性（denaturation）：高温加热，使模板DNA双链之间的氢键断裂，双链分开而成单

    链（94℃，30s）

    2、退火（annealling）：温度降低，使引物与模板DNA中互补区域结合成杂交分子（55℃，

    30s）

    3、延伸（extension）：在DNA聚合酶、dNTPs、Mg2存在下，DNA聚合酶催化引物按5’→3’方向延伸，合成出与模板DNA链互补的DNA子链

    （70～72℃，30～60s）以上述三个步骤为一个循环，每一循的产物均可作为下一个循环的模板，经过n次循环后，目的DNA以2n的形式增加。

四、注意事项：

    1、实验所用溶液都应该没有核酸和（或）核酸酶（DNase和RNase）污染

    2、所有PCR试剂中使用的水都应是高质量的、新鲜蒸馏的去离子水，并且是用0.22μm过

    滤及经过高压灭菌的

    3、在20℃到25℃贮存的试剂建议添加类似叠氮钠的抗微生物剂，在扩增试剂或样品制备试

    剂中加入0.025%的叠氮钠不抑制扩增反应

    4、所用试剂都应该以大体积配制，实验判断试剂是否符合要求，然后分装成仅够一次使用

    的量进行贮存

    5、准备试剂和样品的过程中都要使用一次性灭菌的瓶子和管子

    6、新配制的试剂在用于准备新的标本之前应该加以检验

    7、样品准备和前PCR区所使用的移液管在不使用时应小心保存

五、荧光定量PCR中的常用术语：

    1、CT值：荧光信号有统计意义显著增长(即穿过阈值线)时的循环次数，或者说是从基线到

    指数增长的拐点所对应的循环次数，CT值与起始模板的量成线性关系

    2、阈值：阈值的默认设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍